Terapia Epigenómica en la enfermedad cerebrovascular hemorrágica

 Tema: La metilación del miARN m6A mediada por metiltransferasa 3 promueve la formación de gránulos de estrés oxidativo en la etapa inicial del accidente cerebrovascular  

Mecanismo epigenómico tratado: Metilación de microRNA 335

Como se lo hizo: In vitro 

1. Cultivo de células neuronales de la corteza de roedores neonatales (ratas Sprague-Dawley) y de células PC12 

2. Sometimiento del cultivo a condiciones de lesión de oxígeno-glucosa (OGD) e inducción de infarto

3. Mediante sistema CRISP-cas 9 se insertaron los plásmidos pCDH-CMV-METTL3 para expresar la función de la proteína metiltransferasa 3 (esta enzima inserta N6-metiladenosina para la maduración de miRNA 335 al insertar N6-metiladenosina)

4. Transfección del miRNA 335 homotípico a las células del cultivo 

5. Técnica de inmunofluorescencia de doble marcado para antígeno intracelular de células T (TIA1) y para la proteína 1 ligadora a proteína activadora de GTPasa (G3BP1), marcadores funcionales de los gránulos de estrés 

6. Extracción de proteínas y RNA de las células del cultivo para analizar por RT-PCR y electrotransferencia 

 Resultados:

1. La metilación a través de la enzima METTL3 aumenta la producción y maduración de miR- 335 en un 59.5% en las células cultivadas, promueve la formación de SG y reduce el nivel de apoptosis de las neuronas y células lesionadas 

2. La inmunofluorescencia demostró la formación de gránulos de estrés en un 57.6% en las células cultivadas 

3. El miRNA 335 degrada el mRNA del factor de terminación de la traducción eucariota (Erf1), conllevando a un arresto de la traducción y forma los gránulos de estrés 

4. Los gránulos de estrés son importantes al detener la traducción de importantes proteínas y ARN mensajeros, ya que los protege durante la etapa aguda del accidente cerebrovascular 

Fuente: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7289951/

Tecnica de edición de Ácidos Nucleicos en la enfermedad cerebrovascular hemorrágica

 La inhibición de Sema4D/ PlexinB1 mejora el daño de la barrera hematoencefálica y mejora el resultado después de un accidente cerebrovascular en ratas 

Tipo de edición: In vivo de células somáticas 

Dirigidas hacia: Gen PLXNB1 el cual codifica para la proteína plexina B1 que activa la proteína inflamatoria semaforina 4D SEMA4D- inhibición de la expresión de ADN

Dirigido por: sistema CRISPR-Cas9

Uso de vectores: Vector lentiviral de ARN guía único (ARNsg)

Órgano/célula a tratar: Barrera hematoencefálica, microglia y endotelio disfuncional del SNC y astrocitos perivasculares cercanos a la arteria cerebral media 

Vía de administración: Parenteral: tres inyecciones corticales en el hemisferio derecho situándose cerca del punto de confluencia anatómica bregma 

Resultados:

Corto plazo: 3 días post-inyección, hubo una reducción de la expresión del sistema SEMA4D/ Plexin B1, decrecimiento del infarto y baja permeabilidad de la barrera hematoencefálica 

Mediano plazo: 7 días post-inyección, reducida respuesta inflamatoria después del infarto cerebral al modificar la acción proinflamatoria CD11b de macrófagos y astrocitos, lo que disminuye la probabilidad del edema local 

Largo plazo: es necesario estudiar la posible acción adversa contra otros marcadores inflamatorios como TNF-a e IL-1b porque podría inmunodeprimir al paciente en otras afecciones 

Fuente: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/29242274/

Terapia con "Stem Cell" en la enfermedad cerebrovascular hemorrágica

 Implantación intracerebral de células madre neurales humanas y recuperación motora después de un accidente cerebrovascular: estudio prospectivo multicéntrico de un solo brazo (PISCE-2)

Tipo de célula: Célula mesenquimal neuronal alogénica CTX0E03 

Método de extracción: Trasplante alogénico de células criopreservadas CTX derivadas del neuroepitelio cortical fetal con el trans gen c-mycER-TAM

Administración: Implantación de células madre mediante inyección esterotáxica en el putamen ipsolateral al infarto cerebral.

23 pacientes se sometieron a implantación de células, una media de 7 meses después del accidente cerebrovascular.

Resultados:

Corto plazo: Uno de los 23 pacientes  mejoro en 2 o más puntos en la subprueba 2 de Action Research Arm Test (ARAT) 3 meses después de la implantación.

Mediano plazo: Tres participantes mejoran en la subprueba 2 de (ARAT) a los 6 meses 

Largo plazo: Se observan efectos adversos relacionados con células hasta los 12 meses de seguimiento. 

 La mejoría en ARAT se observó solo en aquellos con movimiento residual del miembro superior al inicio del estudio 

Obtenido de: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/32041820/

Transgénico en la Enfermedad cerebrovascular hemorrágica

El estudio muestra que las consecuencias patológicas clave de la hemorragia cerebral en humanos se conservan en larvas de pez cebra, destacando el organismo modelo como un valioso sistema in vivo para la investigación preclínica del ICH. Uno de estos modelos es el uso de atorvastatina (ATV) a 24 h post- fertilización para inhibir la vía HMGCR y la biosíntesis de colesterol, el cual exhibe una ruptura espontánea de vasos sanguíneos cerebrales.

 Tema: El uso de larvas de pez cebra para estudiar las consecuencias patológicas de accidente cerebrovascular hemorrágico 

Objetivo: Utilizar larvas de pez cebra transgénicas para estudiar las consecuencias patológicas de la hemorragia cerebral.

Tipo de animal transgénico: Pez cebra dechorionate

Método por el que fue obtenido: 

En una concentración de stock final de 1 uM que resulta en 20% de larvas no hemorrágicas y 80% larvas hemorrágicas.

Uso que se le dio: Mostrar que el ictus hemorrágico en larvas de pez cebra induce una respuesta de lesión cerebral que recapitula aspectos clave de la condición humana. Este pez ofrece modelos consistentes y reproducibles de Ictus hemorrágico, el cual ayudara con futuros estudios de investigación de fármacos.

fig1. ICH + fenotipos de hemorragia cerebral 

Ventajas y desventajas del uso de transgénicos

Ventajas:

1. Alimentos más nutritivos 
2. Producción de biofármacos
3. Los productos obtenidos son genéticamente más resistentes a enfermedades, bacterias
4. Poder obtener herramientas biológicas o bioquímicas
5. Especies animales o vegetales producen alimento de manera más rápida, pudiendo solucionar problemas de escasez y hambre a nivel mundial  

Desventajas

1. Daño a la biodiversidad del planeta
2. Resistencia a los antibióticos 
3. Posibles efectos negativos en la salud a largo plazo 
4. Contaminación del suelo 
5. El producto final puede generar agentes que produzcan alergias alimentarias

Fuentes:

Ejemplo de transgénico en la ECH: https://www.jove.com/t/59716?language=Spanish

Ventajas y desventajas del uso de transgénicos: http://www.ucv.ve/fileadmin/user_upload/facultad_agronomia/Zoologia_Agricola/Manejo_Integrado/Competencia3/Separatas01/BiotecnologIa_Ventajas_y_desv.pdf

ADN recombinante artificial en la enfermedad cerebrovascular hemorrágica y en la naturaleza

ADN recombinante artificial en el ECV hemorrágico 

Tema: Neuroprotección utilizando Eritropoyetina Humana Recombinante en la enfermedad cerebrovascular 

Objetivo: Restauración del flujo sanguíneo cerebral (reperfusión) y la limitación del daño neural (neuroprotección)

Genes a secuenciar o clonar: genes inhibidores de la apoptosis XIAP y cIAP2, 62, 63, 64, 65, 66 y rHuEPO 

Enzimas de restricción: BclXL

Enzima ligasa: Ligasa T4

Vector: plásmido 

Célula receptora: neurona 

Mecanismo de transferencia o inserción del gen: transfección 

Métodos de identificación de clones: cultivo 

La eritropoyetina humana recombinante es una glicoproteína producida en el riñón e involucrada en la proliferación, diferenciación y maduración de los eritrocitos aumentando el suministro de oxígeno de los tejidos. Su acción está mediada por receptores que se encuentran en las paredes del endotelio vascular y en los astrocitos. Es uno de los 10 productos más vendidos por la biotecnología mundial. 

Recombinación de ácidos nucleicos en la naturaleza 

El ADN recombinante es el conjunto de técnicas que permiten aislar un gen de un organismo, para su posterior manipulación e inserción en otro diferente, de esta manera es posible hacer que un organismo animal, vegetal, bacteria, hongo o un virus produzca una proteína que le sea totalmente extraña. 

Por ejemplo los plásmidos que son secuencias de ADN extra cromosómicos que tienen la capacidad de reproducirse autónomamente y algunos de pasar de una célula a otra, convirtiéndose en parte integrante del cromosoma que los acoge. Los plásmidos llevan consigo genes que son capaces de conferir particularidades fenotípicas a las bacterias que los contienen, como la resistencia a los antibióticos. 

Fuentes: 

ADN recombinante artificial: http://revecuatneurol.com/wp-content/uploads/2015/06/Neuroproteccion.pdf

ADN recombinante en la naturaleza: https://www.investigacionyciencia.es/revistas/investigacion-y-ciencia/nacido-del-caos-674/adn-recombinante-14328

Técnica de secuenciación en la enfermedad cerebrovascular hemorrágica

 Tema: Análisis sistemático de ARN pequeños derivados del ARNt revela nuevos objetivos terapéuticos potenciales de la medicina tradicional china sobre la hemorragia intracerebral.

Objetivo: explorar nuevos objetivos terapéuticos de BYHWD (famosa medicina tradicional china) mediante la secuenciación de ARN, para evaluar los niveles de expresión del ARNt.

Muestra: tejido cerebral de rata macho que rodean la región hemorrágica

Ácido nucleico: ARNt

Gen a secuenciar:  Foxo1, Mapk1, Sos1, Smad3

Método de extracción: utilización de kit NextSeq 500/550 V2

Técnica: secuenciación de taRNA

Conclusión: Los ARNt podrían ser nuevos objetivos terapéuticos potenciales para que BYHWD regule las vías biológicas inducidas por ICH

Fuente:  https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6429019/

Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en la enfermedad cerebrovascular hemorrágica

 "La muerte neuronal después de un accidente cerebrovascular hemorrágico in vitro e in vivo comparte características de ferroptosis y nefroptosis"

El estudio tuvo como objetivo identificar los mecanismo subyacentes de muerte celular atribuibles a una lesión por hemoglobina y hemina para ampliar las opciones de tratamiento. Para ello se uso muestras de neuronas corticales primarias de ratones CD-1/ICR en el día 15 embrionario cultivadas a 37°C y expuestas a hemoglobina.

Estudios demuestran que el aumento en el mensaje de los genes RIP1 y RIP3 median la muerte celular necroptótica y que los niveles de ARNm de estos genes aumentan con hemina.

Para la extracción de ARN total se usó el kit de aislamiento ARN NucleoSpin, realizaron PCR en tiempo real usando Taqman RNA-to-CT 1-Step Kit para ratón RIP1 y RIP3. 

Llegando a la conclusión de que los mediadores tóxicos establecidos a partir de hemina y hemoglobina, indujeron la muerte de estas neuronas a través de características de muerte celular ferroptótica o necroptótica. 

Referencias:

1. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5613764/